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Bernhard Eikmanns macht Bodenbakterium industrietauglich

Forschen für das Bücherregal ist Bernhard Eikmanns Sache nicht. Also sagte der Biologe den schwer kultivierbaren Mikroben seiner Promotion leichten Herzens Lebewohl und landete bei Corynebacterium glutamicum. Der Mikroorganismus lohnt nicht nur wissenschaftliche Beschäftigung. Mit Stämmen dieses keulenförmigen Bodenbakteriums produziert die Industrie auf fermentativem Weg Aminosäuren wie Glutamat und Lysin im Maßstab von Millionen Tonnen. L-Glutamat und Lysin werden wie fast alle 20 Aminosäuren, die für die Proteinsynthese benötigt werden, aus Zwischenstufen des Glucoseabbaus und des Zitronensäurezyklus gebildet.

Am Massachusetts Institute of Technology bei Tony Sinskey lernte der heute 53-jährige Mikrobiologe 1987, wie man dem Mikroorganismus mit gentechnischem Werkzeug und Methoden zu Leibe rückt. Der 1957 isolierte Organismus war da erstmals in den Blick anwendungsnaher molekularbiologischer Forschung geraten.

Was trägt das Corynebakterium zur biobasierten Wirtschaft der Zukunft bei?

Erarbeitet Lösungen für die Bioökonomie der Zukunft: Prof. Bernhard Eikmanns. © Pytlik

Fünf Jahre dauerte es etwa, bis sich das Bodenbakterium gentechnisch so zurichten ließ wie das bekannteste Haustier der Biotechnologen, Escherichia coli. In Jülich am Forschungszentrum, in Düsseldorf, wo er habilitierte, und schließlich seit 1997 am Ulmer Institut für Mikrobiologie und Biotechnologie (Direktor Peter Dürre) versucht Eikmanns seither den Stoffwechsel des rund 3.300 Gene umfassenden Mikroorganismus zu verstehen und ihn für technische Zwecke zu optimieren. Mit Partnern aus der Industrie, vor allem Evonik Industries, arbeitet er seit vielen Jahren - zu beider Nutzen - zusammen.

Seit Ende der 80er Jahre betreibt Eikmanns, was heute „weiße oder industrielle Biotechnologie" heißt. Im weltweiten Forschungswettstreit um nachhaltige Lösungen für eine biobasierte, postfossile Wirtschaft setzt der Ulmer Wissenschaftler in europäischen Konsortien (ERA-IB) auf „sein" Bakterium. Möglicherweise lassen sich die am Corynebakterium gewonnenen Erkenntnisse auf einen entfernten Verwandten, den pathogenen Keim Mycobacterium tuberculosis, übertragen und medizinisch nutzen. Eine Kooperation mit dem Ulmer Kollegen Steffen Stenger (Institut für Medizinische Mikrobiologie und Hygiene) und Hannoveraner Kollegen (Medizinische Hochschule) hat ermutigende Zwischenergebnisse geliefert, die Eikmanns vertiefen will.

Corynebacterium glutamicum: ein geborener Produzent

Die Bodenmikrobe Corynebacterium glutamicum lässt sich leicht kultivieren und verträgt hohe Zelldichten. © Eikmanns

Heute, nach Jahrzehnten erfolgreicher Forschung, wundert sich Eikmanns immer noch über diese Mikrobe: Robust sei sie gegen viele Umwelteinflüsse, ihr Stoffwechsel vergleichsweise wenig reguliert, und sie verfüge über viele „Schleuser"-Proteine, die Stoffwechselmetabolite aus der Zelle transportieren. Für die Zelle sei es eigentlich sinnlos, diese Zwischenprodukte zu verlieren, weil ihr Energie und Substrat fehlen, sagt Eikmanns. Eine zufriedenstellende Erklärung des Phänomens haben die Forscher nach wie vor nicht.

Biotechnologen greifen in den Stoffwechsel dieses Aminosäureproduzenten an vier Stellen ein: bei der Aufnahme des Substrats (bislang Glucose), dem Zentralstoffwechsel, den Biosynthesewegen und schließlich beim Transport der Aminosäuren aus der Zelle. Eikmanns Forschungsansatz („Man interessiert sich nicht für das, was eigentlich selbstverständlich ist - genau das wollen wir machen") ‚bescherte' seiner Arbeitsgruppe eine deutliche Steigerung der Lysin-Produktivität von C. glutamicum. Aus den Erlösen des verkauften Patentes rüstete er sein Uni-Labor auf mit Analytik für Aminosäuren und Proteinchemie. 

Erstmals die Seitenwege des Stoffwechsels untersucht

Bis 1998/99, sagt Eikmanns, erschöpfte sich die komplette Forschung an diesem und weiteren Organismen darin, die eigentlichen Biosynthese-Wege zu untersuchen. Unbeachtet blieb der Transport aus der Zelle, auch an die Vorstufenbereitstellung dachte außer Eikmanns niemand.

Der Ulmer wollte wissen, welches Zwischenprodukt es braucht, um einen Seitenweg des Stoffwechsels zu beschreiten, wollte wissen, wie sich die Bildung eines Zwischenproduktes beeinflussen lässt und wie dieses reguliert wird. Er entdeckte, dass Zwischenprodukte im Augenblick ihrer Anhäufung selbst Prozesse des Stoffwechsels hemmen, dass man sich auch diese „Nebenwege" anschauen musste, um beispielsweise zu Lysin zu gelangen. Eikmanns nennt das die Biochemie der Vorstufenbereitstellung. Über diesen „zweiten Weg" entdeckte er eine Reihe neuer Enzyme und stellte fest, dass der Organismus viel einfacher als andere ist und über parallele Biosynthesewege verfügt.

Schleuser-Proteine: Der Weg nach draußen

Knappe 3.300 Gene zählt das mikrobielle Genom. © Jörn Kalinowski/Andreas Tauch, CeBiTec, Uni Bielefeld

Stoffe müssen im Zellinneren erst eine gewisse Konzentration erreichen, ehe Transportproteine in Aktion treten und diese Metabolite in das Nährstoffmedium ausscheiden. Es muss, erklärt Eikmanns ein Jahrzehnt Transportforschung bündig, eine bestimmte Anzahl von Molekülen vorliegen, um dieses Schleuser-Enzym zu aktivieren: „Was transportiert wird, muss auf das Protein treffen". Ehe dessen Konzentration erhöht werden kann, müssen die Forscher aus den durch Sequenzierung bekannten 150 Membran-Proteinen erst im Abgleich mit denen in Hefen oder E. coli ein gutes Dutzend dieser ‚Schleuser-Verdächtigen' identifizieren. Auf die Anreicherung mit solchen Schleuser-Proteinen in den Wildtyp reagieren die Stämme ohne Probleme, so dass diese Stämme ihre Transportrate deutlich erhöhen können.  

Rein erkenntnisorientierte Forschung findet in Eikmanns zwölfköpfiger Arbeitsgruppe parallel zur anwendungsnahen weißen Biotechnologie statt. So entdeckten die Wissenschaftler zufällig, dass das Corynebakterium auch Arabitol, einen in der Natur vorkommenden fünfwertigen Zuckeralkohol verstoffwechselt. Das haben die Ulmer überprüft, bestätigt und im bakteriellen Genom drei Gene ausfindig gemacht, die Arabit in eine zentrale, auch bei anderen Organismen bekannte Zwischenstufe umwandeln. Ob sich diese neuen Gene der drei Enzyme, die am Arabitol-Stoffwechsel beteiligt sind, biotechnologisch anwenden lassen, stand bislang noch nicht auf der Agenda. Zuerst mussten diese Enzyme biochemisch identifiziert und charakterisiert werden, um dann festzustellen, dass diese Enzyme, die am Arabitol-Stoffwechsel beteiligt sind, von einem Protein reguliert werden.

Trotz ihrer großen industriellen Bedeutung sind erst 1.500 Stoffwechsel-Reaktionen der Bodenmikrobe bekannt, rund 2.000 Reaktionen liegen noch im Dunkel, schätzt Eikmanns - eigentlich genügend Arbeit für die knappe Hundertschaft von Corynebakterien-Forschern. Der Ulmer hingegen glaubt, dass es den gläsernen völlig beherrschbaren Organismus selbst in 25 Jahren noch nicht geben werde, was nicht bedauerlich sei, weil dieser im Labor möglicherweise mit der Hälfte der Gene auskomme.

Mikrobielle Fabrik für Biosprit und chemische Grundstoffe

Abgesehen von solch akademischer Sichtweise spielen Bakterien wie Corynebacterium glutamicum als mögliche Produzenten chemischer Grundstoffe eine nicht unerhebliche Rolle für den Übergang zu einer erdölfreien Wirtschaft. Immer wieder ist in diesem Zusammenhang auch von Biosprit die Rede, dessen Beimischung (B10) in hiesige Verbrennungsmotoren ins Gerede gekommen war. Eikmanns Lösungsvorschlag heißt Isobutanol, nicht Ethanol. Mit neu kombinierten Stoffwechselwegen ließe sich in Mikroben wie dem Corynebakterium Isobutanol auf fermentativem Weg sehr effektiv herstellen. Isobutanol lässt sich als Treibstoff zusetzen, auch als Vorstufe zu Isobuten nutzen, ein Rohstoff zur Kunststoffherstellung, der bislang aus Erdöl produziert wurde.

Herausforderung Substratwechsel: Zellulose statt Zucker

Wie viele andere Biotechnologen arbeitet Eikmanns daran, das Substratspektrum dieser Mikroorganismen zu erweitern, um dem Tank-oder-Teller-Dilemma zu entkommen. Denn noch braucht das Corynebakterium Glucose, einen Rohstoff, der mit der Nahrungsmittelproduktion konkurriert. Als alternatives Substrat käme Zellulose in Betracht, die aus den beiden momentan für die Lebensmittelherstellung nicht genutzten C5-Zuckern Xylose und Arabinose besteht. Was Eikmanns und Kollegen vorschwebt, ist angeblich US-Forschern schon geglückt, aus mit Zellulose gefütterten Clostridium-Mikroben Isobutanol herzustellen (W. Higashide, Y. Li, Y. Yang, J. C. Liao. Metabolic Engineering of Clostridium Cellulolyticum for Isobutanol Production from Cellulose. Applied and Environmental Microbiology, 2011; DOI: 10.1128/AEM.02454-10).

Welcher Mikroorganismus taugt als Biofabrik?

Mit europäischen Kollegen versucht Eikmanns in einem Projekt (BioProChemBB) die Eignung des Corynebakteriums als Produktionsort für die Plattformchemikalien Succinat, Fumarat, Malat, Aspartat und Itaconat zu testen. Erste Erfolge gibt es nach Eikmanns Worten: Einer dieser Grundstoffe (Succinat/Bernsteinsäure) werde mithilfe von Pilzen hergestellt; große Firmen seien im Begriff, Produktionsanlagen aufzubauen. Bei anderen Grundstoffen allerdings dauere die Umsetzung noch einige Jahre.

Während Forscher wie Eikmanns Bernsteinsäure mithilfe von Corynebakterien herstellen wollen, versuchen es andere mit Hefen. Anders als Bakterien halten diese saurere pH-Werte aus. Das als Bernsteinsäure ausgeschiedene Succinat mache das Medium sauer, weshalb zwei der neun Partner in dem EU-Projekt versuchen, die pH-Empfindlichkeit des Bakteriums zu verstehen. In einem weiteren Schritt sollen Produktionsstämme entwickelt werden, die den Stress der Dicarbonsäure aushalten, und schließlich soll die Machbarkeit eines biobasierten Herstellungsverfahrens (die Hochskalierung) gezeigt werden.

Vielseitig: Corynebakterien können auch Therapeutika produzieren

Mit gentechnisch veränderten Stämmen gelang es Eikmanns, die Produktion der industriell begehrten Aminosäure L-Valin deutlich zu steigern. © Eikmanns
Das Corynebakterium kommt auch als Produktionsstätte von 2-Ketoisovalerat in Frage. Diese bislang chemisch hergestellte Aminosäurenvorstufe (von L-Valin, L-Leucin) wird als Therapeutikum für Nierenkranke eingesetzt und könnte sich als kleiner, aber feiner Markt (1 Gramm chemisch synthetisiertes 2-Ketoisovalerat kostet etwa 400 Euro) etablieren. Entsprechende Produktionsstämme hat Eikmanns Arbeitsgruppe entwickelt (Krause, F.; Blombach, B.; Eikmanns, B.: Metabolic Engineering of Corynebacterium glutamicum for 2-Ketoisovalerate-Production, in: Applied and Environmental Microbiology, Dec. 2010, p. 8053-8061, doi: 10.1128/AEM.01710-10.) Eikmanns gelang es auch durch Eingriffe in den Stoffwechsel des Corynebakterien-Wildtyps, die Ausbeute der Aminosäure L-Valin im Vergleich zu den Ausbeuten der ersten Generation deutlich zu steigern; unerwünschte Beiprodukte wie Pyruvat scheiden die neuen Produktionsstämme nicht mehr aus. Die Aminosäure ist essenziell für Wirbeltiere und wird für Infusionslösungen, Kosmetika und als Vorstufe für die chemische Herstellung einiger Pestizide eingesetzt. Da die Produktionsausbeuten unter den theoretisch möglichen Margen liegen, hat die Industrie nach wie vor ein starkes Interesse an effizienteren Produktionsstämmen. Die an Modellorganismen erzielten Verbesserungen sind auch der industriellen Produktion eines Partners zugute gekommen, sagt Eikmanns. (Blombach, B.; Schreiner, M.; Bartek, T.; Oldiges, M.; Eikmanns, B.: Corynebacterium glutamicum tailored for high-yield L-valine production, in: Applied Microbiology and Biotechnology (2008), 79; 471-479, doi: 10.1007/s00253-008-1444-z).

Lässt sich der Tbc-Erreger über den Stoffwechsel knacken?

Ein Verbundprojekt mit Ulmer und Hannoveraner Kollegen könnte die Arbeit des Corynebakterium-Experten Eikmanns erstmals in medizinische Bahnen lenken. Der Ulmer Forscher glaubt, dass sich seine Expertise auf einen entfernten Verwandten, Mycobacterium tuberculosis, anwenden lässt. Die Pathogenitätsmechanismen dieses Erregers, der für jährlich zwei Millionen Todesfälle verantwortlich ist, sind zwar sehr gut untersucht, nicht aber dessen Stoffwechsel.

Diese Mycobakterien überwintern in Makrophagen und ernähren sich dort nicht von Zucker, sondern von Fettsäuren. Eikmanns Arbeitsgruppe hat in C. glutamicum den Abbau und die Regulation kurzkettiger Fettsäuren sehr intensiv untersucht. Dabei stießen sie auf einen globalen Regulator des Zentralstoffwechsels, den Eikmanns Kooperationspartner auch in den Mycobakterien fanden. Der Einbau des entsprechenden Gens in den jeweils verwandten Mikroorganismus verlief erfolgreich: das mycobakterielle Fremdgen erfüllte im Corynebakterium dieselbe Funktion wie umgekehrt. Hier könnte sich ein neues pharmakologisches Ziel zur Bekämpfung dieses Erregers ergeben, denn der menschliche Organismus kennt diesen Stoffwechselweg zum Fettsäureabbau nicht. Demnächst, hofft Eikmanns, kann er die Arbeit vergeben, die diese Proteine identifiziert und charakterisiert, die dem Erreger das Überleben ermöglichen. Damit wäre ein neuer Ansatz begonnen, jenseits der Virulenzfaktoren.

Schöne neue Welt der synthetischen Biologie

Die traditionelle Nutzung von Corynebakterien als Aminosäure-Produzenten wird nach Eikmanns Einschätzung den Forscherertrag zunehmend begrenzen. Stattdessen werde sich diese anwendungsnahe Forschung in Richtung synthetische Biologie bewegen. Isobutanol konnte C. glutamicum nur deshalb produzieren, weil der Mikrobe ein neu zusammengesetzter Stoffwechselweg aus anderen Organismen eingesetzt wurde. Kritik an solchen völlig neuartigen Produkten aus der Retorte kann Eikmanns nachvollziehen. Dennoch glaubt er, dass diese Synthese neuer Organismen im Grundsatz ungefährlich ist, da sie Verbindungen entstamme, die im menschlichen und pflanzlichen Stoffwechsel auch vorkommen.

Glossar

  • Aminosäuren sind die Bausteine der Proteine; es gibt insgesamt 20 verschiedene Aminosäuren in Proteinen.
  • Bakterien sind mikroskopisch kleine, einzellige Lebewesen, die zu den Prokaryoten gehören.
  • Biotechnologie ist die Lehre aller Verfahren, die lebende Zellen oder Enzyme zur Stoffumwandlung und Stoffproduktion nutzen.
  • Enzyme sind Katalysatoren in der lebenden Zelle. Sie ermöglichen den Ablauf der chemischen Reaktionen des Stoffwechsels bei Körpertemperatur.
  • Escherichia coli (Abk.: E. coli) ist ein Colibakterium, das im menschlichen Darm vorkommt. Varianten dieses Colibakteriums (E. coli K12), denen bestimmte, für das Überleben in freier Wildbahn notwendige Eigenschaften des Wildtypbakteriums fehlen, werden in der Gentechnik häufig als so genannter Empfängerorganismus für die Klonierung von rekombinanten DNA-Stücken eingesetzt.
  • Ein Gen ist ein Teil der Erbinformation, der für die Ausprägung eines Merkmals verantwortlich ist. Es handelt sich hierbei um einen Abschnitt auf der DNA, der die genetische Information zur Synthese eines Proteins oder einer funktionellen RNA (z. B. tRNA) enthält.
  • Das Genom ist die gesamte Erbsubstanz eines Organismus. Jede Zelle eines Organismus verfügt in Ihrem Zellkern über die komplette Erbinformation.
  • Gentechnik ist ein Sammelbegriff für verschiedene molekularbiologische Techniken. Sie ermöglicht, DNA-Stücke unterschiedlicher Herkunft neu zu kombinieren, in geeigneten Wirtszellen zu vermehren und zu exprimieren.
  • Für den Begriff Organismus gibt es zwei Definitionen: a) Jede biologische Einheit, die fähig ist, sich zu vermehren und selbstständig, d. h. ohne fremde Hilfe, zu existieren (Mikroorganismen, Pilze, Pflanzen, Tiere einschließlich Mensch). b) Legaldefinition aus dem Gentechnikgesetz: „Jede biologische Einheit, die fähig ist, sich zu vermehren oder genetisches Material zu übertragen.“ Diese Definition erfasst auch Viren und Viroide. Folglich fallen gentechnische Arbeiten mit diesen Partikeln unter die Bestimmungen des Gentechnikgesetzes.
  • Pathogenität ist die Fähigkeit, eine Krankheit zu verursachen. Man unterscheidet zwischen human-, tier- und pflanzenpathogenen Erregern, die eine Krankheit spezifisch bei Mensch, Tier oder Pflanze hervorrufen.
  • Proteine (oder auch Eiweiße) sind hochmolekulare Verbindung aus Aminosäuren. Sie übernehmen vielfältige Funktionen in der Zelle und stellen mehr als 50 % der organischen Masse.
  • Nukleotidsequenzen sind Abfolgen der Basen Adenin, Thymin, Guanin und Cytosin auf der DNA (bzw. Uracil statt Thymin bei RNA).
  • a) DNA-Sequenzierung ist eine Methode zur Entschlüsselung der Erbinformation durch Ermittlung der Basenabfolge. b) Protein-Sequenzierung ist eine Methode zur Ermittlung der Aminosäurenabfolge.
  • Allgemein ist mit Virulenz die Fähigkeit eines Krankheitserregers gemeint, seinen Wirt zu infizieren. Bei Bakteriophagen bezeichnet man damit die Eigenschaft, seinen Wirt nach Infektion zu lysieren.
  • Fermentiation ist die Bezeichnung für die Umsetzung von biologischen Materialien mit Hilfe von Mikroorganismen oder durch Zusatz von Enzymen (Fermenten). Im eigentlichen Sinn handelt es bei der Fermentation um die anaerobe Oxidation von Zuckern zum Zwecke der Energiegewinnung des metabolisierenden Organismus.
  • Biochemie ist die Lehre von den chemischen Vorgängen in Lebewesen und liegt damit im Grenzbereich zwischen Chemie, Biologie und Physiologie.
  • Die Molekularbiologie beschäftigt sich mit der Struktur, Biosynthese und Funktion von DNA und RNA und und deren Interaktion miteinander und mit Proteinen. Mit Hilfe von molekularbiologischen Daten ist es zum Beispiel möglich, die Ursache von Krankheiten besser zu verstehen und die Wirkungsweise von Medikamenten zu optimieren.
  • Glutamat ist eine Aminosäure und damit Baustein von Eiweißen. Im zentralen Nervensystem ist Glutamat außerdem der wichtigste erregende Neurotransmitter (Botenstoff). Es wird dort in den Synapsen der Nervenzellen freigesetzt und bindet an spezifische Glutamat-Rezeptoren.
  • Die Pharmakologie ist eine Wissenschaft, die sich mit der Wechselwirkung zwischen Arzneimitteln und Organismen befasst. Dabei gibt es zwei Verfahren zur Beurteilung: Die Pharmakokinetik beschreibt die Aufnahme, Verteilung, Verstoffwechselung und Ausscheidung des Wirkstoffs, die Pharmakodynamik beschreibt die Wirkung des Arzneimittels im Organismus.
  • L-Lysin ist eine basische und essentielle Aminosäure.
  • Cellulose ist ein wasserunlösliches Polysaccharid, das den Hauptbestandteil der pflanzlichen Zellwand bildet. Die Grundeinheit der Cellulose ist die Glucose.
  • Glucose ist ein Monosaccharid (Einfachzucker). Sie kommt als D-Glucose in fast allen süßen Früchten vor und trägt den Trivialnamen Traubenzucker. Glucose bildet den Mittelpunkt des Kohlenhydrat-Stoffwechsels.
  • Die Bernsteinsäure ist eine organische Säure, die sowohl als Stoffwechselprodukt als auch in vielen Früchten, Gemüsen und fossilen Harzen vorkommt. Ihr Salze heißen Succinate.
  • Fettsäuren sind Carbonsäuren (organische Säuren) die oft aus langen, unverzweigten Kohlenstoffketten bestehen. Sie können entweder gesättigt oder ungesättigt sein und sind Bestandteil von Fetten und Ölen.
  • Fossile sind aus der erdgeschichtlichen Vergangenheit stammende Überreste von Tieren oder Pflanzen.
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