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Trenzyme - Rekombinante Proteine optimal exprimiert

Die Trenzyme GmbH in Konstanz bietet Dienstleistungen im Bereich Genomics und Proteomics an. Das Unternehmen hat sich auf Auftragsforschung und individuelle Services für Forschung und Entwicklung spezialisiert und arbeitet selbst an neuen sowie verbesserten Produkten und Verfahren. So wurde in jüngster Vergangenheit eine neue Methode zur schnellen Identifizierung von optimalen Expressionsbedingungen für rekombinante Proteine entwickelt.

„Rekombinante Proteine sind in den Life-Sciences von zentraler Bedeutung“, erklärt Dr. Reinhold Horlacher, Gründer und Geschäftsführer der Trenzyme GmbH die Fokussierung des Unternehmens auf diesen Bereich. Diese werden in der pharmazeutischen Industrie als Wirkstoffe zur Bekämpfung einer Krankheit eingesetzt, etwa als therapeutische Antikörper. Des Weiteren spielen sie auch in der pharmazeutischen Forschung und Entwicklung eine wichtige Rolle. In der industriellen Biotechnologie dienen Enzyme als Werkzeuge zur Stoffumsetzung. Oft werden rekombinante Proteine in großen Mengen benötigt, was nur durch eine effektive und qualitativ hochwertige Produktion möglich wird. Darum setzt Trenzyme eine hauseigene neue Methode zur Identifizierung von optimalen Expressionsbedingungen für rekombinante Proteine ein.

Ein Bausatz für viele Fragestellungen

Dr. Reinhold Horlacher, Gründer und Geschäftsführer der Trenzyme GmbH, arbeitet an der Optimierung von Expressionsbedingungen für rekombinante Proteine. © Trenzyme GmbH

Das Konstanzer Unternehmen nutzt hier ein sehr modulares „Baukasten“-System, mit dem eine Fragestellung mit vielen Variationen beantwortet werden kann. Die Module werden aus Elementen in verschiedenen Ebenen zusammengestellt. Zuerst wird aus einer Kollektion an E. coli-Stämmen, Hefen, Insekten- und Säugerzellen der Wirtsorganismus ausgewählt, in dem das Protein exprimiert werden soll. Durch diese Entscheidung wird die zur Verfügung stehende Vektorpalette festgelegt, da die Vektoren für bestimmte Wirte angepasst sind. Welche Vektoren aus dieser Palette dann genau zum Einsatz kommen, wird anhand der bekannten Eigenschaften des Zielproteins bestimmt, wie beispielsweise sekretierte oder cytoplasmatische Expression in Säugerzellen, Induzierbarkeit des Proteins, oder die Kopplung an Affinitätsmarker.

„Für die bakteriellen Systeme ist die Auswahl an Vektoren besonders groß, es gibt zum Beispiel verschiedene Promotoren, Resistenzmarker oder unterschiedliche Kopienzahlen der Vektoren“, beschreibt Horlacher die Möglichkeiten. „Außerdem sind alle der mehr als 70 eingesetzten Vektoren gleich aufgebaut, so dass eine Zielsequenz gezielt in einem Schritt und ohne zeitraubende Modifikationsschritte in jeden dieser Vektoren eingesetzt werden kann“, erläutert Horlacher weiter. Die Auswahl sinnvoller Kombinationen erfolgt auch aufgrund früherer Erfahrungen und entsprechend der Zielsetzung. „Weist das gewünschte Protein zum Beispiel Glykosylierungen auf, so fällt E. coli als Wirt aus, da Bakterien Proteine nicht glykosylieren“, erklärt Horlacher.

Bei dieser ergebnisoffenen Herangehensweise werden so zuerst kleine Mengen des Proteins in einer maximalen Anzahl an sinnvollen Variationen exprimiert, um die quantitativ und qualitativ optimalen Bedingungen zu identifizieren. In einem zweiten Schritt werden diese optimalen Bedingungen dann im großen Maßstab zur Expression eingesetzt und dabei weiter verfeinert. „Zentral ist hierbei natürlich ein guter "Readout" für die Qualität des Proteins, also meist die Aktivität“, erläutert Horlacher. Wie wichtig dieser zusätzliche Test ist, zeigt sich im Laboralltag der Trenzyme GmbH. So ist es schon geschehen, dass ein Protein im ersten Schritt in E. coli und in Säugerzellen mit verschiedenen Vektor-Konstrukten exprimiert und anschließend auf Enzymaktivität getestet wurde. Die Expression fand in beiden Systemen statt, in E. coli sogar im größeren Maßstab. „Doch der Aktivitätstest zeigte, dass nur in den Säugerzellen ein funktionsfähiges Enzym synthetisiert wurde, so dass E. coli als Wirtsorganismus für dieses Protein ausschied“, schildert Horlacher. Wenn es für ein Protein keine gute Messmethode für die Qualität gibt, hilft die Trenzyme GmbH deshalb auch bei der Etablierung eines maßgeschneiderten Assays.

Homogene Zelllinien durch ExoIN-Technologie

In einem Mikro-Bioreaktor können aus einer Vielzahl von Wirt-Vektor-Kombinationen diejenigen mit der besten Proteinexpression und –aktivität bestimmt werden. © Trenzyme GmbH

Die Modularität und Breite des Systems wird durch spezielle technische Feinheiten in der Anwendung ermöglicht. „Wir haben einige neue Elemente wie die ExoIN-Technologie in unser System eingearbeitet“, berichtet Horlacher. ExoIN ist eine hauseigene Methode der Trenzyme GmbH zur Erzeugung von homogen exprimierenden, stabilen Zelllinien. Das dafür eingesetzte ExoIN-Vektorsystem koppelt die Synthese des Target-Proteins an die Synthese eines Selektionsmarkers, zum Beispiel einer Antibiotika-Resistenz. Im Gegensatz zu vielen anderen Systemen erfolgt die Kopplung hierbei auf Proteinebene, so dass beide Proteine gemeinsam translatiert werden. Ist nach der Transfektion das Marker-Protein vorhanden, muss auch das Target-Protein exprimiert sein, so dass alle unter Selektionsdruck wachsenden Zellen das Target-Protein produzieren. „Ein großer Vorteil der Technologie ist neben der unglaublichen Geschwindigkeit die Möglichkeit, verschiedene Expressionslevel des Targets gezielt einzustellen – das bietet so kein anderes System und ist gerade bei funktionalen Fragestellungen von unschätzbarem Wert“, erläutert Horlacher weiter.

Zelllinienentwicklung als zukunftsweisendes Standbein

Seit der Gründung im Jahr 2000 als Spin-off-Unternehmen der Universität Konstanz ist die Trenzyme GmbH kontinuierlich gewachsen. Gestartet mit einem Gründerteam bestehend aus zwei jungen Forschern, beschäftigt das Unternehmen inzwischen 14 Mitarbeiter und ist seit 2009 sogar vom TÜV Süd nach DIN EN ISO 9001:2008 zertifiziert. Durch ein elektronisches Qualitätsmanagementsystem zur Unternehmensführung und Dokumentation der Prozesse wird so Transparenz für die Auftraggeber geschaffen.

Zum Kernbereich, der Produktion von rekombinanten Proteinen, kam 2007 als neues Standbein die Entwicklung und Herstellung von stabilen Säugerzelllinien dazu. „Als Entwicklungspartner von globalen Pharma- und Biotech-Unternehmen haben wir seitdem bereits mehr als 300 stabile Zelllinien entwickelt, in denen ein gewünschtes Protein exprimiert oder stillgelegt wird“, berichtet Horlacher. Die neuen Entwicklungen führten 2009 zur Gründung der Tochterfirma Cytobox, die auf die Zelllinien-Herstellung spezialisiert ist. Das Dienstleistungsangebot der Trenzyme GmbH umfasst aber den gesamten Weg vom Gen zum Plasmid, zum Protein und zur Zelllinie und das dafür nötige Spektrum der Molekularbiologie, Proteinbiochemie und Zellkultur.

Auch in den kommenden Jahren forscht die Trenzyme GmbH weiterhin an neuen Methoden und Anwendungen, vor allem im Bereich Zellkultur. „Zur Zeit arbeiten wir unter anderem an der Herstellung transfektionskompetenter Zelllinien, auch Primärzellen, die bis zur Verwendung im Stickstoff gelagert werden können“, verrät Horlacher. Diese Technologie wurde auch letztes Jahr an die Lonza Group AG auslizensiert, einem der führenden Anbieter von Produkten und Dienstleistungen für die Pharma-, Gesundheits- und Life-Sciences-Industrien.

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